近日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院陳業(yè)團(tuán)隊(duì)于國際期刊Metabolic Engineering發(fā)表研究論文"Versatile xylose and arabinose genetic switches development for yeasts"。該研究利用來自曲霉菌種的轉(zhuǎn)錄激活因子XlnR和AraR^A以及細(xì)菌轉(zhuǎn)錄阻遏因子XylR和AraR^R，在酵母中開發(fā)了基于廉價(jià)誘導(dǎo)劑的高誘導(dǎo)強(qiáng)度，低泄漏的木糖和阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)。

釀酒酵母作為重要的真核模式生物和細(xì)胞工廠，已經(jīng)有大量的天然或人工誘導(dǎo)系統(tǒng)被開發(fā)。但是，用于實(shí)際生產(chǎn)的大規(guī)模發(fā)酵的誘導(dǎo)系統(tǒng)依然局限于內(nèi)源的半乳糖(GAL)系統(tǒng)。然而，半乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)存在若干不足，主要表現(xiàn)在對葡萄糖的抑制作用導(dǎo)致生長與生產(chǎn)過程難以分離，以及復(fù)雜的內(nèi)源調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在不同營養(yǎng)條件下導(dǎo)致誘導(dǎo)動力學(xué)行為的復(fù)雜性。此外，基因表達(dá)的誘導(dǎo)依賴于易降解且成本較高的半乳糖。D-木糖和L-阿拉伯糖作為農(nóng)業(yè)廢棄物（如秸稈）水解產(chǎn)物的主要組分，具有成本低廉的優(yōu)勢。鑒于釀酒酵母無法天然降解這些糖類，它們成為理想的專一性誘導(dǎo)劑，可用于生產(chǎn)大量化學(xué)品或蛋白質(zhì)。

自2015年以來，科學(xué)家已經(jīng)在酵母中開發(fā)了一些木糖基因表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)。過往的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)大多基于原核生物的阻遏轉(zhuǎn)錄因子XylR^R構(gòu)建，但是這些系統(tǒng)都有一個(gè)普便存在的問題：最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平偏低，且轉(zhuǎn)錄因子的濃度需要細(xì)調(diào)以避免引發(fā)宿主生長毒性。內(nèi)在調(diào)控原理-阻遏轉(zhuǎn)錄因子的去阻遏以及原核生物與真核生物的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制的截然不同，決定了很難改造已有的木糖轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)系統(tǒng)。

文章上線截圖

絲狀真菌是生態(tài)環(huán)境中的分解者，具有強(qiáng)大的分解代謝能力，因此研究團(tuán)隊(duì)著重在這類菌種中篩選能響應(yīng)木糖及阿拉伯糖的轉(zhuǎn)錄激活因子。通過構(gòu)建基于熒光報(bào)告基因的篩選系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)最終找到了來自構(gòu)巢曲霉和黑曲霉的轉(zhuǎn)錄激活因子-XlnR (AN7610)和AraR^A (An04g08600)，能在釀酒酵母中分別劑量響應(yīng)木糖及阿拉伯糖并啟動下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

為克服天然啟動子的局限性，如序列冗長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號多樣及結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，研究團(tuán)隊(duì)采用結(jié)構(gòu)緊湊的釀酒酵母ADH2強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動子作為基礎(chǔ)，將XlnR的結(jié)合一致性序列xlno替換ADR1的結(jié)合序列，成功開發(fā)出響應(yīng)木糖的半合成啟動子，顯著增強(qiáng)了木糖誘導(dǎo)下的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過構(gòu)建TSS與TATA-box、TATA-box與poly(A)區(qū)域間隔序列的文庫，并調(diào)整轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序（motif）的數(shù)量，成功開發(fā)出具有廣泛動態(tài)范圍的全合成誘導(dǎo)啟動子。

基于轉(zhuǎn)錄激活因子的誘導(dǎo)系統(tǒng)通常泄漏水平較高，為應(yīng)對泄漏水平較高的問題，研究團(tuán)隊(duì)引入了原核生物的轉(zhuǎn)錄阻遏抑制信號，并設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)錄激活/抑制的雙調(diào)控系統(tǒng)。這一創(chuàng)新使得木糖雙調(diào)控系統(tǒng)的動態(tài)范圍擴(kuò)展至4000倍以上，且最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到釀酒酵母強(qiáng)組成型啟動子TDH3活性的兩倍以上。同樣阿拉伯糖雙調(diào)控誘導(dǎo)系統(tǒng)動態(tài)范圍達(dá)300倍，最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性與TDH3啟動子活性相當(dāng)。重要的是，農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米芯未經(jīng)處理的水解物也可以充分激活該木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)。最后，研究團(tuán)隊(duì)綜合比較了本研究開發(fā)的木糖及阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)與釀酒酵母中常用的誘導(dǎo)系統(tǒng)（天然系統(tǒng)如GAL系統(tǒng),Cu²⁺誘導(dǎo)啟動子P_CUP1,甲硫氨酸抑制啟動子P_MET3以及基于雌激素受體ER的合成誘導(dǎo)系統(tǒng)LexA-ER-VP16/B112），證實(shí)木糖雙調(diào)控系統(tǒng)就調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)性，誘導(dǎo)激活水平、動態(tài)范圍、誘導(dǎo)速度和對宿主的生長影響方面優(yōu)于現(xiàn)有系統(tǒng)。

研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了這兩套誘導(dǎo)系統(tǒng)在高滴度（>100 mg/L）芳樟醇生產(chǎn)中的實(shí)用性，同時(shí)證實(shí)了使用玉米芯水解物作為唯一碳源和誘導(dǎo)劑來源，也能實(shí)現(xiàn)高滴度芳樟醇的生產(chǎn)。最后，團(tuán)隊(duì)也證明了基于XlnR的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)可遷移到工業(yè)菌株如畢赤酵母、病原菌如光滑念珠菌和白色念珠菌（CUG支系酵母）。在畢赤酵母中，基于XlnR的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)的最大誘導(dǎo)水平高于其經(jīng)典的甲醇誘導(dǎo)系統(tǒng)，并證實(shí)了其用于生產(chǎn)分泌蛋白的實(shí)用性。

本研究不僅為酵母提供了強(qiáng)大的遺傳開關(guān)，還提出了一種將激活/抑制信號整合到合成啟動子中的通用策略，以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)性能。

木糖及阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)開發(fā)策略，設(shè)計(jì)原理及應(yīng)用

本文第一作者是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員郭淑慧，通訊作者是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員陳業(yè)。該工作獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金，以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。

團(tuán)隊(duì)相關(guān)亮點(diǎn)成果

通過與該研究相似的轉(zhuǎn)錄因子重構(gòu)結(jié)合合成啟動子方法，以及對于轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及啟動子模塊的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)，可以在釀酒酵母及大腸桿菌中對于任意轉(zhuǎn)錄信號進(jìn)行優(yōu)化。基于該方法，陳業(yè)團(tuán)隊(duì)與湖南大學(xué)的合作成果，以"On-Chip Engineered Living Materials as Field-Deployable Biosensing Laboratories for Multiplexed Detection"為題，已在Advanced Functional Materials期刊上發(fā)表，中國科學(xué)院大學(xué)碩士黎欣睿完成了細(xì)胞傳感器的開發(fā)。

原文鏈接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202416830

基于微流控芯片的現(xiàn)場可部署的ELM生物傳感實(shí)驗(yàn)室（ELMlab-on-Chip）設(shè)計(jì)原理